Elisa

Four kinds of Elisa (enzyme-linked immunosorbent assay)

Elisa는 sandwich, Competitive, direct, indirect 요렇게 총 4가지로 구분되어진다.

https://www.cusabio.com/c-20659.htmlㅇ

Four Types of ELISA-CUSABIO

여기 잘 정리되어 있음 :) 

 

나는 host에 antigen을 injection 하고 host가 얼마나 항체를 만들어 내는지를 indirect Elisa를 통해 분석하였다.

순수하게 Elisa 실험만 3일에 거쳐 진행된다. ( plate에 coating 할 antigen을 정제해야 되면 더 시간이 걸리겠쥬?)

 

Day.1.

첫날은 immunopate (SPL, cat#32296, 114,400원) 에 antigen을 coating 한다.

Antigen의 concentration은 0.5ug/ml이 되도록 coating buffer에 섞고, 100ul씩 plate에 분주한다. 

4℃에서 O/N 반응한다. 뭐 그냥 특별히 교반 하지 않아도 무방하다.

 

Day.2.

*200ul의 washing buffer로 3번 세척한다.

well당 균일한 작업이 가능하려면 multi pipette의 사용은 필수이다. reservoir를 사용하는 게 편리하다.

필자의 실험실에서는 무식하게 reservoir를 안 쓰고 petridish를 쓰기도 했는데,

(Integra, cat# 4312, 139,000원) 정도 하니 방장에게 하나 사달라고 졸라 보자. 

washing 할 때는 multi pipette으로 buffer를 전부 다 넣어주고 한 번에 뒤집으면서 3번 정도 털어주자. 

*Blocking buffer 200ul - 37℃-1h 반응.

*200ul의 washing buffer로 3번 세척한다.

* 0.1% BSA + PBS 시약에 serum을 dilution 해서 well에 넣어 준다. / 4℃에서 O/N 반응한다.

보통 positive serum을 dilution 하는 과정을 거쳐서 얼마 정도의 농도를 넣는 게 좋을지 예비 실험 정도는 한다.

 

Day.3.

*200ul의 washing buffer로 3번 세척한다.

*host Ig 항체를 RT - 30m 반응한다. /

이건 보통, 항체 회사에서 권장하는 concentration 이 있기 때문에 따라준다.

*200ul의 washing buffer로 3번 세척한다.

*2차 항체를 넣어준다. Goat anti mouse Ig-Ap (concentration 2ug/ml) RT - 30m 반응한다. /

여기서 어떤 기질이 conjugation 된 항체를 쓰느냐에 따라, substrate를 구매할 때 달라지니 잘 생각하고

실험실에 어떤 항체가 있는지 어떤 substrate가 있는지 잘 알아보자.

*200ul의 washing buffer로 3번 세척한다.

*Substrate solution - pNPP 200ul 넣어주고 암실에서 30m 반응한다. 

*Stop solution - 3M NaOH 50ul 넣어주면 된다.

*plate reader기에 넣어서 맞는 파장에서 plate를 읽어준다.

 

 

Buffer 조성.

*Coating buffer / 냉장보관

Coating buffer	pH 9.6
Sodium carbonate	1.5g
sodium bicarbonate	2.93g
Distilled water	1L

*PBS / 냉장보관

PBS
Dibasic - Na2HPO412H2O	35.814	500ml
Monobasic - NaH2PO42H2O	15.601	500ml
pH	7.4

monobasic을 dibaisc에 넣어 주면서 pH 7.4로 맞춘다.  / 일반적인 cell culture에 사용하는 PBS랑 좀 다르다.

 

*Washing buffer / 냉장보관

PBS 500ml + 2.5ml (100% tween20) => 0.5%)

 

*Blocking buffer 

PBS + 1%BSA / PBS 50ml - BSA 0.5g

 

*PNPP-AP Substrate. / 냉장보관

Diethanolamine buffer를 먼저 만들어 주고, 여기에 쓸 때마다 PNPP를 섞어 줘야 한다.

Buffer 25ml 기준으로 / Diethanolamine (sigma, cat# D0681, ?) /

Diethanolamine	26.285g
MgCl2	2.5mg
pH 9.8	10M HCl

이렇게 넣어 준다. 필자의 경우 약 200~300ml을 만들어서 냉장 보관하였다.

PNPP (4-Nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate, sigma, cat# N2765-50TAB, ?) 

이게 tablet 형태로 나오는데, 1mg/ml의 농도가 되도록 섞어준다. 

tablet 하나가 20mg 이기 때문에 20ml의 Diethanolamine buffer에 섞으면 된다. 

이게 반응이 안되었을 때는 투명하다. / 그렇기 때문에 혹시 장기간 냉장 보관을 하였을 시에는 시약 색을 확인해주어야 하고, 

빛을 차단해주는 게 좋다.

PNPP-AP substrate의 경우 405nm에서 읽으면 된다. 

 

*Stop solution.

3M NaOH

200ul PNPP-AP substrate - 50ul 반응. 

 

자 그럼 이만 빠이