Hi-C experiments_Bioinformatic analysis_#1

최근 애플에서 비전프로라는 제품을 발표하면서, 공간 컴퓨팅 (spatial computing)이라는 단어를 강조하였다. 나는 그걸 들으면서, Hi-C가 떠올랐는데, 알다시피 DNA는 linear 한 것이 아니라 접혀있고, 구부러져 있고 하기 때문에 공간적으로 바라볼 필요가 있으며, Hi-C는 이러한 DNA를 평면상이 아닌 삼차원에서 보기 위한 하나의 분석 방법이라 보면 된다.

Hi-c library를 제작하였으면 이를 sequencing 하여야 한다. 150bp short read pair-end로 읽을 것이며, 원하는 실험의 목적에 맞게 sequencing depth로 읽어 주면 된다. 더 높은 resolution의 정보를 얻고 싶다면, 더 많이 읽으면 된다 (돈을 더 쓰면 된다.)

실험 species의 genome size 또한 고려하여야 하는데, 약 3Gb의 Human genome을 기준으로 하였을 때 300 million read pair는 A/B compartment와 TAD 그리고, 600 million read-pairs 정도면 chromatin loops까지 분석할 수 있는 높은 해상도의 data를 얻을 수 있다. (우리의 연어 친구도 salmonid specific whole genome duplication을 거치면서 genome size가 상당히 커졌고, 약 2.8Gb 정도 된다.) 시퀀싱의 depth를 Gb 또는 million read로 이야기하는데, 그때 [converter](https://alitheagenomics.com/gb-to-million-reads-converter)를 쓰면 편하다.

TAD 이상의 데이터를 원했기 때문에 샘플당 약 600M (180Gb)의 pair-end를 sequencing을 진행하였고, 간단하게 1. sequencing 자체의 quality control을 확인하는 것과 2. 읽어진 read가 ligation motif를 가지는지 한번 보는 것이다.

ligation motif에 대해 자세히 이야기하기 위해 다시 library prep의 과정을 간단하게 recap 하자면, Hi-C는 DNA를 crosslinking 시킨 후, 제한효소로 조각을 낸다. 잘려나간 부분에 biotin probe를 붙이고, ligation을 진행한다. 이때 ligation은 spatially 가까울수록 더 잘 일어나게 되며, DNA를 shearing 하고 ligation 된 부분의 DNA는 biotin probe를 가지고 있기 때문에 이것만 따로  pull down 하여 모은 후 sequencing을 진행한다.  ligation motif는 결국 공간적으로 가까운 DNA사이의 흔적이라 볼 수 있으며, MboI (DpnII)와 HinfI를 사용하였으므로, 각각 ^GATC와 G^ANTC 서열에서 ^ 부분을 잘라낸다. 따라서 두 절단 부위로 인해 생길 수 있는 ligation motif는 GATCGATC, GANTGATC, GANTANTC, 그리고 GATCANTC 가 있을 수 있다. 따라서 terminal에서 head 명령어를 통해 몇 개의 sequencing read들을 보면서, ligation motif를 가지는 것을 확인해 보는 것은 library prep이 얼마나 잘 진행되었는지 가늠할 수 있는 하나의 parameter가 될 수 있다 생각한다. (motif가 read 내에 한 개 또는 여러 개 존재하기도 한다.)

그럼 sequencing quality도 확인하였고, 대략적인 ligation motif의 여부들도 확인을 하였으면, 다음에는 진짜 분석을 시작하도록 하자.