선배, ligation이 안되는데요?

분자생물학 실험을 하다보면 vector를 제작하여 실험에 사용하게 되는 일이 생기기 마련이다.

요즘은 In fusion cloning이니, overlap cloner니, gibson assembly니 여러가지 vector를 조각내어 붙이는 

기술들이 많이 있지만 (이것들도 시간이 나면 썰을 풀도록 하겠다),

그 이전까지만 해도 제한효소를 처리하여 잘라내는 것이 대부분 이었다.

그러면 다음과 같은 지루한 싸움이 시작된다.

 

1) Restriction enzyme을 고른다, 

- 이때, 내가 넣으려는 backbone vector에는 존재하지 않는, non-cutter들을 찾아 주고,

혹시나 두 enzyme이 compatible sticky end를 가지는지 확인을 꼭 해줘야 한다. 

예를 들어, NheI 과, XbaI 은 compatible한 sticky end를 가진다. / 그러면 self-ligation 되기 때문에 ligation이 힘들어 진다.

2) Enzyme site가 들어간 primer를 디자인해서 cloning을 한다. 

3) Cloning 산물의 sequencing을 확인한다. 

4) Insert가 들어간 vector와 이를 삽입할 backbone vector에 제한 효소를 처리한다.

5) 겔을 자른다.

6) T4 ligase를 반응한다.

- T4 ligase는 상온에서 2h, 4℃ O/N 등등 뭐 대충해도? 붙는다...

7) Transformation을 한다.

- competent cell 의 효율을 꼭 확인하자. / CaCl2만 넣어서 만드는 competent cell은 제발 이제 그냥 보내주자

8) colony PCR을 돌린다.

- 꼭 backbone vector와 insert를 걸쳐서 돌린다.

9) 맞는 size의 밴드가 있다 - 10)으로 가시오 

    맞는 size의 밴드가 없다 - 6) 으로 가시오

10) sequencing을 확인한다. 

 

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후배 M모씨; 선배, 저는 이렇게 했는데 왜 안될까요?

젊은 꼰대; 자 그럼, 혹시 backbone vector만 T4 ligase 반응해서 Transformation 해 봤니? 라고 물어본다.

후배 M모씨; 아니요

젊은 꼰대; 응 해봐

후배 M모씨; 네,

그리고 며칠 후 

후배 M모씨; 선배, colony가 많이 생겼는데요?

젊은 꼰대; 응 너 backbone vector가 다 안잘렸어, vector 자르는 조건 부터 다시 잡아 보자.

후배 M모씨;

선배, 저는 제한효소 처리할때, prep 산물 17ul, 10x buffer 2ul, enzyme 1ul 넣어라고 배웠는데, 무슨 조건을 잡아야 하는거죠?

젊은 꼰대; ..... (마음의 소리 ; 마.... 제한효소 unit 수 공부하라고 안했나?)

자, 이 친구야, 

제한효소는 뭐 넣기만하면 무한대로 잘라주는줄 아니? 그 녀석도 다 잘라주는 기준이 있단다...

우리가 보통 사용하는 enzyme은 10units/ul 정도가 된단다... 

자 그럼 1units은 뭐에요? 1ug의 DNA를 한시간동안 자르는 100% 잘라내는 걸 의미한단다.

자 그럼, 우리가 1ul 넣어주면, 10unit이 될터이고, 1시간동안 10ug의 DNA를 잘라주는걸 의미하겠지? 

그런데 너는 DNA 니 맘대로 넣고 enzyme이 쥐꼬리 만큼 넣어준 거였으면 어뜩할래?

vector가 충분히 잘렸을 조건을 잡아보자.,

나같으면 DNA의 양을 일정하게 두고, unit을 늘려보도록 하겠다.. 

ex)

DNA 10ug / enzyme 1ul (10units) / overnight 반응

DNA 10ug / enzyme 2ul (20units) / overnight 반응

DNA 10ug / enzyme 3ul (30units) / overnight 반응

그리고, 내린 후 gel 잘라서, Transformation 해봤을때,

colony가 안뜨면 그 조건의 backbone으로 ligation 반응을 해보자.

 

선배, ligation이 안되요

해결책 -

1. 잘, 자르자.

2. competent cell 효율을 높이자.

 

 

사진 출처-

www.addgene.org/protocols/dna-ligation/