Dual-Glo luciferase assay.

Dual-Glo luciferase assay는 Transfection efficiency를 보정하면서 reporting을 할 수 있는 system이다. 

예를 들어, A cell line에 A vector를 동일한 방법으로 transfection 한다고 하더라도, 반복구 마다, vector가 cell에 들어가는 효율이 어느 정도 차이를 보이기 때문에 그 차이를 최소화시키기 위해 fire fly와 Renillia라는 2개의 reporting을 통해 값을 보정할 수 있는 방법이다.

특히나 transfection efficiency가 낮은 cell line에서는 그 차이를 보기 힘들 수도 있고, 한개를 reporting 하는 것보다 훨씬 정확한 data를 낼 수 있다.

나의 경우에는 promega의 Dual-Glo luciferase assay kit를 여름이나 연말 할인할때 사서 쓴다. Cat# E2920 / (273,000)

(그냥사면 호구다... 꼭 할인할 때 재고를 구비해두자.. 게다가 가격도 사악하니...)

그러면 transfection 할 vector는 어떻게 구하느냐? Addgene에 들어가서 pmiRGLO-라고 검색해서 맘에 드는 걸로 산다.

vector를 보면, hRluc가 transfection efficiency를 보정해주는 reporter가 되고, firefly luciferase 가 우리가 보고자 하는 reporter가 된다.

이 system의 경우 한개의 vector를 가지고 하기 때문에 더 정확하게 볼 수 있다. 

 

Dual-Glo luciferase assay kit를 수령하면, 내용물은 이렇다. 

1) Dual-Glo® Luciferase Substrate

2) Dual-Glo® Luciferase Buffer

3) Dual-Glo® Stop & Glo® Substrate

4) Dual-Glo® Stop & Glo® Buffer

 

나는 수령해서 Buffer는 30도 이상에 substrate는 -20도에 보관한다가.

처음 사용할때, 

2번 Buffer를 1번 Substrate에 넣어서 전부를 분주하고 (640ul) -70도에 보관한다. / -70도는 필수다. 안 그러면 점점 효율이 떨어짐. 

 

 

 

그러면 실험에 들어가보자. 

 

Day1. 

보통은 96well에 cell을 1~2x10^4으로 culture 하고, 다음날 transfection을 한다.

 

Day2. 

pmirglo vector를 100ng transfection 한다. 보통 transfection 할때는 0% FBS이니까 cell cycle이 멈춰 있을 거고, 

normal 배지인 FBS 10% media로 change 해주는 타임부터 약 48h 이후에 각각의 luciferase를 측정한다.

나의 경우, 6h or 12h 이후에 10% media로 교환해주고, 그로부터 48h 이후에 luciferase를 측정한다.

배지를 넣어줄때, 나의 경우 100ul or 200ul 넣어준다

 

Day4.

배지를 전부 교환해서 새로운 배지 75ul를 넣거나, total이 75ul가 되도록 배지를 덜어준다. / 둘 다 해봤는데 큰 차이가 없었다. 어차피 두 luciferase가 배지로 secretion 되는 것이 아니라 cell을 lysis 시켜서 그 안에 있는 각각의 luciferase를 측정하는 것이기 때문에. 

배지 75에 1) +2) 시약 75ul를 넣어준다. 그리고 상온에서 10m ~2h 동안 plate 교반기에 두고 lysis 시킨 후 firefly lucifersae를 측정한다.

측정은 plate reader기가 luciferase를 잡아 줄 수 있으면된다. 

측정하고 그 다음에는 4번 buffer에 3번 substrate를 0.75 넣어서 mixture를 만들고 그것을 75ul 넣어 준다.

동일하게 상온에서 plate 교반기에서 10m ~ 2h 이내에 반응시키고 Renilla luciferase를 측정한다.

 

- 상온에서 반응하는 time은 cell 마다 다르고 condition을 잡아야 한다.

- plate는 luciferase background가 적은 white를 사용해야 하며, 밑이 투명하고 옆면이 white인 것은 매우 비싸다... 

그래서 그냥 96 well plate 투명한 것에 cell을 culture 하고, 1차 plate 교반까지 끝낸 후에 150ul를 white plate로 옮겨서 firefly를 측정하는 방법을 사용한다. / 이것 또한 밑이 투명해서 cell을 볼 수 있고, 옆면에 white인 것과 위의 방법을 둘 다 사용해 보았지만, 큰 차이가 없었다.

 

각각의 luciferaes를 측정해서 firefly/renilla로 값을 보정한다. 

끝 :)