효율 좋은 Competent cell 직접 만들어 쓰자.

제목 그대로 효율 좋은 컴셀을 만들어 쓰자.
혹시 컴셀을 싸서 쓰는가?
아니면 DH5ɑ로 컴셀을 만들 때 CaCl2 방법을 쓰는가?
만약에 그렇다면 글을 읽고
꼭 한번만 test 해보시길..

Bric에 들어가면 간간히 ligation이 안되요. vector가 안만들어져요. 와 같은 아우성들이 보인다.
물론 여러 변수가 있겠지만, 낮은 컴셀의 효율이 아마 가장 큰 원인으로 생각된다.

이번에 소개할 방법은 INOUE method, ultracompetent cell 이라는 이름으로 불리는 것이다.
이 방법의 핵심은 낮은 온도에서 오래 오래 culture하는 것.
DH5a, XL1-blue, DB3.1, JM109등의 균주에서 높은 효율을 보인다 (1x10^7이상)
BL-21 이랑 그 유사 친구들에서는 효율이 별로...

우선 만들 버퍼들.
0.5M PIPES (pH 6.7) - 100ml
PIPIES 15.1g에 3차 증류수 60ml 넣고 KOH로 pH를 맞춰준다.
(처음 pH가 2.7로 매우 낮아서 5M KOH 가 15ml 정도 들어가는걸 감안해서 잘 맞춘다. )
다 녹이고 pH 맞춘 후 100ml로 mass up 한다.
0.45um syringe filter를 실시한다.

INOUE Transformation(TF) buffer - 1L
800ml 3차 증류수에 아래와 같이 시약을 넣는다.

그리고 미리 만든 5M PIPES를 20ml 넣어 준다.
그리고 1L로 mass up 하고 0.45um bottle top filter를 한다.
40ml 씩 분주해서 INOUE TF buffer는 -20℃냉동실에 보관한다.

자 그럼 컴셀을 만들어 보자.

Day1.
- 컴셀을 LB plate에 streaking 하고 37도 배양.
1LErlenmeyer flask 3개에 LB Broth 250ml 되도록 만들어서 autoclave 돌린다.

Day2.
- LP Plate에서 single colony를 picking해서 10ml LB broth가 들어간 50ml conical에 배양한다.
37℃ 쉐이킹 인큐베이터에서 250rpm으로 6~8시간 배양한다.
autoclave 돌려놓은 1LErlenmeyer flask 3개에
배양액을0.5ml, 1ml, 2ml 넣어주고 18℃ 쉐이킹 인큐베이터에 150rpm으로 키운다.
*얼려놓은 INOUE TF buffer 2개를 냉장고로 옮긴다.

Day3.
이때 생각보다 잘 안자라는데, 25h 이후 부터 1시간 정도의 간격으로 OD값을 측정한다.
OD값이 0.55에 도달하면 flask안의 균액을conical tube 6개로 옮겨 닮고 on ice를 10m 한다.
4℃ 세팅해서 3,000rpm에 10m간 원심분리 한다.
pellet을 남기고 상층액을 전부 버린다.
INOUE TF buffer로 pellet을 전부 사알 사알 풀어준다.
(INOUE TF buffer는 차갑게 계속 유지 중)
여기서 total 60ml 의 TF buffer를 사용하고 6개를 2개로 나누어 담는다.
다시 4℃, 3,000rpm에 10m간 원심분리 한다.
상층액을 전부 이쁘게 버린다.
차가운 INOUE TF buffer 20ml로 pellet을 전부 풀어 준다.
Conical tube 하나로 모으고 1.5ml DMSO 넣어서 잘 섞어주고
다시 on ice 10m 한다.
이제 50ul씩 분주한다.
재빠르게 -70℃에 보관한다.

참고로 생각보다 어렵지 않다.
만드는 사람의 노하우에 따라 효율의 차이가 보일 수 있으나, CaCl2 방법보다는 무조건 좋다...
Transformation efficiency 계산 비교 결과.

분주할때, Cryo-Safe에 e-tube를 꽂아놓고 분주하면 좋다.
모든 작업은 당연 클린벤치 안에서..